所有產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于食用和醫(yī)療等

 重組蛋白表達(dá)純化服務(wù)

原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)是迄今為止zui為成熟可靠的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，能快速表達(dá)純化各種不同來(lái)源蛋白。大量制備的重組蛋白可用于藥物篩選、結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究、細(xì)胞生物學(xué)研究、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等的一系列生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。

特點(diǎn)：

• 本公司可以通過(guò)原核蛋白小量表達(dá)測(cè)試的工藝放大，在中試級(jí)別的體系中獲得重組蛋白。
• 可以根據(jù)客戶的需要提供各種表達(dá)標(biāo)簽，包括His、GST、MBP、NusA、 TrxA、 Sumo、 AviTag™等。
• 本公司可以通過(guò)離子交換、透析超濾、凝膠過(guò)濾、親和層析等方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行精細(xì)的分離純化。
• 本公司可提供靈活的標(biāo)簽系統(tǒng)的純化方案，甚至復(fù)合標(biāo)簽的純化方案。
• 可獲得純度90%以上的重組蛋白，本公司的CoolCut技術(shù)還可以獲得無(wú)標(biāo)簽的重組蛋白。
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)SDS–PAGE凝膠電泳檢測(cè)。交付時(shí)間: 4–6周。

• 具有20多種表達(dá)用菌株，可獲得高產(chǎn)的工程菌。
• 擁有表達(dá)克隆構(gòu)建、多功能標(biāo)簽的選擇，密碼子優(yōu)化等相關(guān)技術(shù)服務(wù)；可有效地解決高產(chǎn)工程菌基因工程問(wèn)題。

注意：

• 本公司在本項(xiàng)服務(wù)中提供的重組蛋白不保證活性。
• 本公司在本項(xiàng)服務(wù)中的收費(fèi)需要協(xié)商，可按蛋白毫克數(shù)和純度定價(jià)；也可按過(guò)柱次數(shù)定價(jià)。

重組蛋白用途：

• 抗原蛋白
• 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品
• 蛋白活性研究

服務(wù)內(nèi)容

1. 大腸桿菌（E. coli）表達(dá)系統(tǒng)

2. 畢赤酵母（P. pastoris）表達(dá)系統(tǒng)

3. 桿狀病毒（Baculovirus）表達(dá)系統(tǒng)

4. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

價(jià)格與信息

一：大腸桿菌（E. coli）表達(dá)系統(tǒng)

步驟

1. 目標(biāo)基因全基因合成：

1.從基因庫(kù)中搜索目標(biāo)蛋白的cDNA序列。

2.根據(jù)選用的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)cDNA進(jìn)行密碼子，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等的優(yōu)化。

3.合成設(shè)計(jì)好的基因序列。

交付內(nèi)容：目的基因（在T載體或常規(guī)穿梭載體上）及測(cè)序報(bào)告。

時(shí)間：2周

步驟2. 目標(biāo)基因亞克隆：

1.擴(kuò)增并抽提含有目標(biāo)基因的載體質(zhì)粒。

2.將目標(biāo)基因亞克隆到合適的表達(dá)質(zhì)粒上。

3.測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

4.可提供表達(dá)載體（PET系列為主）

交付內(nèi)容：正確構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測(cè)序報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟3. E. coli 表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化及篩選：

1.擴(kuò)增并抽提構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒。

2.將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到高效的E. coli表達(dá)菌株中。

3.至少挑選5個(gè)陽(yáng)性克隆于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增并選擇合適的條件，SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，篩? 選出合適菌株。

4.可提供表達(dá)菌株：DH5α, *0, JM115, BL21 （DE3）, BL21 （DE3） pLys, XL1 Blue等。

交付內(nèi)容：重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株及表達(dá)檢測(cè)報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟4. 目標(biāo)蛋白表達(dá)及純化：

1.對(duì)時(shí)間，溫度以及IPTG濃度等表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白。

2.搖瓶培養(yǎng)1L重組細(xì)菌，通過(guò)親和，離子交換，疏水及凝膠過(guò)濾等層析方法純化表達(dá)的重組蛋白。

3.利用蛋白酶去除不需要的純化標(biāo)簽（Tag），再純化獲得所需的目標(biāo)蛋白（可選，構(gòu)建表達(dá)載體需加入合適的蛋白酶切位點(diǎn)）。

4.通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)每步結(jié)果并控制zui終產(chǎn)品質(zhì)量。

5.通過(guò)Western-blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白正確性

交付內(nèi)容：純化好的目標(biāo)蛋白5~10mg及純化報(bào)告。可按客戶要求提供含純化標(biāo)簽（Tag）或切除純化標(biāo)簽（Tag）的zui終蛋白，純度zui高可達(dá)95%以上。

時(shí)間：2-3周

說(shuō)明：

1. 如果沒(méi)有獲得目標(biāo)蛋白，則不收取任何費(fèi)用。如果zui終得到的產(chǎn)品未達(dá)到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費(fèi)用。

2. 如果客戶需要詳細(xì)的純化工藝，包括詳細(xì)純化條件及每步結(jié)果，則需要加收100%相應(yīng)費(fèi)用。

3. 因?yàn)槊總€(gè)重組蛋白的表達(dá)量及純化得率都不相同，我們zui終根據(jù)實(shí)際情況將給客戶提供zui少5mg，zui多10mg的目標(biāo)蛋白，所收取的費(fèi)用是相同的。

4. 我們提供的zui終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因?yàn)槲覀儫o(wú)法為每個(gè)定制的蛋白建立活性檢測(cè)系統(tǒng)，所以我們無(wú)法保證zui終產(chǎn)品的生物學(xué)活性，不過(guò)我們承諾將會(huì)按照zui大可能保護(hù)其活性的方法來(lái)制備目標(biāo)蛋白。如果客戶一定要求目標(biāo)蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測(cè)活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標(biāo)蛋白給客戶并只收取本步驟費(fèi)用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標(biāo)蛋白給客戶并需要加收本步驟費(fèi)用的100%。

5. 每次Western-blot檢測(cè)zui多7個(gè)樣品，因?yàn)橐尤腙?yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以及Marker。本步驟只包含一次免費(fèi)檢測(cè)，如果需要更多次檢測(cè)則需另收費(fèi)。我們可以免費(fèi)為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測(cè)結(jié)果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測(cè)結(jié)果（可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或是假陰性的結(jié)果）。如果結(jié)果不正常，我們可以免費(fèi)重做一次。

步驟5. 目標(biāo)蛋白的再加工及詳細(xì)檢測(cè)：

1.對(duì)生物學(xué)活性要求較高的純化后蛋白產(chǎn)品進(jìn)行復(fù)性研究。

2.內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進(jìn)一步加工。

3.通過(guò)HPLC，質(zhì)譜等方法詳細(xì)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的質(zhì)量

服務(wù)內(nèi)容：

1復(fù)性研究：利用多達(dá)20種不同復(fù)性緩沖液的體系，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行小量復(fù)性試驗(yàn)提供復(fù)性后樣品供客戶檢測(cè)，可

根據(jù)客戶要求，按照其中一種樣品的復(fù)性條件制備小量的復(fù)性蛋白，可提供具體的復(fù)性緩沖液配方及復(fù)性工藝。

2：除內(nèi)毒素，

3：過(guò)濾除菌，

4：凍干，5：HPLC檢測(cè)，

6：質(zhì)譜檢測(cè)，

7：N端測(cè)序。

交付內(nèi)容：加工后的終產(chǎn)品及相關(guān)實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟6. 大規(guī)模制備：

按照小試工藝放大生物試劑規(guī)模，制備客戶需要的合格蛋白產(chǎn)品。

交付內(nèi)容：合格的目標(biāo)蛋白及服務(wù)報(bào)告。

時(shí)間：協(xié)商

二：畢赤酵母（P. pastoris）表達(dá)系統(tǒng)

步驟1. 目標(biāo)基因全基因合成：

1.從基因庫(kù)中搜索目標(biāo)蛋白的cDNA序列。

2.根據(jù)選用的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)cDNA進(jìn)行密碼子，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等的優(yōu)化。

3.合成設(shè)計(jì)好的基因序列。

交付內(nèi)容：目的基因（在T載體或常規(guī)穿梭載體上）及測(cè)序報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟2. 目標(biāo)基因亞克?。?/p>

1.擴(kuò)增并抽提含有目標(biāo)基因的載體質(zhì)粒。

2.將目標(biāo)基因亞克隆到合適的表達(dá)質(zhì)粒上。

3.測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

4.可提供表達(dá)載體：pPICZα和pPIC9K和pGAPCZα。

交付內(nèi)容：正確構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測(cè)序報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟3. P. pastoris表達(dá)菌株電轉(zhuǎn)化：

1.酶切線性化表達(dá)質(zhì)粒。

2.將表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化到高效的P.pastoris表達(dá)菌株中。

3.通過(guò)PCR鑒定至少挑選5個(gè)陽(yáng)性克隆。

4.可提供表達(dá)菌株：X33，GS115，KM71和SMD1168。

交付內(nèi)容：PCR陽(yáng)性克隆及PCR結(jié)果報(bào)告

時(shí)間：2周

步驟4. P. pastoris 表達(dá)菌株篩選：

1.將5個(gè)陽(yáng)性克隆于BMGY培養(yǎng)基中擴(kuò)增，然后換至BMMY培養(yǎng)基中，并加入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白。

2.SDS-PAGE電泳檢測(cè)培養(yǎng)上清中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，并挑選合適的單克隆菌株用于目標(biāo)蛋白的表達(dá)

3.如果培養(yǎng)上清中檢測(cè)不到表達(dá)，則通過(guò)將上清濃縮20倍作用再檢測(cè)，或通過(guò)Western-blot方法檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)（客戶需要提供相關(guān)抗體）。

交付內(nèi)容：陽(yáng)性克隆菌株及表達(dá)篩選結(jié)果報(bào)告。

時(shí)間：2周

步驟5. P. pastoris表達(dá)菌株表達(dá)優(yōu)化：

1.挑選20個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行常規(guī)表達(dá)篩選，并對(duì)其中表達(dá)菌株優(yōu)化表達(dá)條件。

2.對(duì)挑選出來(lái)的單克隆菌株，優(yōu)化培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件（培養(yǎng)基，菌體密度，甲醇濃度，誘導(dǎo)時(shí)間等），提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

交付內(nèi)容：三個(gè)陽(yáng)性克隆菌株及優(yōu)化表達(dá)條件結(jié)果報(bào)告。。

時(shí)間：2周

步驟6. 目標(biāo)蛋白表達(dá)及純化：

1.搖瓶培養(yǎng)1L重組酵母菌，誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白。

2.通過(guò)親和，離子交換，疏水及凝膠過(guò)濾等多種層析方法純化表達(dá)的重組蛋白。

3.通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)每步結(jié)果并控制zui終產(chǎn)品質(zhì)量。

4.通過(guò)Western-blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白正確性。

交付內(nèi)容：純化好的目標(biāo)蛋白1~10mg及純化報(bào)告?？砂纯蛻粢筇峁┖兓瘶?biāo)簽（Tag）或切除純化標(biāo)簽（Tag）的zui終蛋白，純度zui高可達(dá)90%以上。

時(shí)間：2-3周

說(shuō)明：

1. 如果沒(méi)有獲得目標(biāo)蛋白，則不收取任何費(fèi)用。如果zui終得到的產(chǎn)品未達(dá)到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費(fèi)用。

2. 如果客戶需要詳細(xì)的純化工藝，包括詳細(xì)純化條件及每步結(jié)果，則需要加收100%相應(yīng)費(fèi)用。

3. 因?yàn)槊總€(gè)重組蛋白的表達(dá)量及純化得率都不相同，我們zui終根據(jù)實(shí)際情況將給客戶提供zui少1mg，zui多10mg的目標(biāo)蛋白，所收取的費(fèi)用是相同的。

4. 我們提供的zui終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因?yàn)槲覀儫o(wú)法為每個(gè)定制的蛋白建立活性檢測(cè)系統(tǒng)，所以我們無(wú)法保證zui終產(chǎn)品的生物學(xué)活性，不過(guò)我們承諾將會(huì)按照zui大可能保護(hù)其活性的方法來(lái)制備目標(biāo)蛋白。如果客戶一定要求目標(biāo)蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測(cè)活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標(biāo)蛋白給客戶并只收取本步驟費(fèi)用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標(biāo)蛋白給客戶并需要加收本步驟費(fèi)用的100%。

5. 每次Western-blot檢測(cè)zui多7個(gè)樣品，因?yàn)橐尤腙?yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以及Marker。本步驟只包含一次免費(fèi)檢測(cè)，如果需要更多次檢測(cè)則需另收費(fèi)。我們可以免費(fèi)為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測(cè)結(jié)果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測(cè)結(jié)果（可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或是假陰性的結(jié)果）。如果結(jié)果不正常，我們可以免費(fèi)重做一次。

步驟7. 目標(biāo)蛋白的再加工及詳細(xì)檢測(cè)：

1.內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進(jìn)一步加工。

2.通過(guò)HPLC，質(zhì)譜等方法詳細(xì)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的質(zhì)量。

服務(wù)內(nèi)容：

1：除內(nèi)毒素，

2：過(guò)濾除菌，

3：凍干，.

4：HPLC檢測(cè)，

5：質(zhì)譜檢測(cè)，

6：N端測(cè)序。

交付內(nèi)容：加工后的終產(chǎn)品及相關(guān)實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)報(bào)告。

時(shí)間：2周

步驟8. 大規(guī)模制備：

按照小試工藝放大生物試劑規(guī)模，制備客戶需要的合格蛋白產(chǎn)品。

交付內(nèi)容：合格的目標(biāo)蛋白及服務(wù)報(bào)告。

時(shí)間：協(xié)商

三：桿狀病毒（Baculovirus）表達(dá)系統(tǒng)

步驟1. 目標(biāo)基因全基因合成：

1.從基因庫(kù)中搜索目標(biāo)蛋白的cDNA序列。

2.根據(jù)選用的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)cDNA進(jìn)行密碼子，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等的優(yōu)化。

3.合成設(shè)計(jì)好的基因序列。

交付內(nèi)容：目的基因（在T載體或常規(guī)穿梭載體上）及測(cè)序報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟2. 目標(biāo)基因亞克隆到pFastBac供體質(zhì)粒：

1.擴(kuò)增并抽提含有目標(biāo)基因的載體質(zhì)粒。

2.將目標(biāo)基因亞克隆到pFastBac供體載體上。

3.測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

4.通過(guò)中抽獲得重組的質(zhì)粒DNA

交付內(nèi)容：正確構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測(cè)序報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟3. 制備重組桿狀病毒Bacmid DNA：

1.將重組的pFastBac供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)菌株中。

2.通過(guò)抗生素平板篩選出含有重組Bacmid的菌株。

3.抽提質(zhì)粒獲得重組的桿狀病毒Bacmid DNA。

交付內(nèi)容：重組桿狀病毒Bacmid DNA，含重組質(zhì)粒的DH10Bac菌株

時(shí)間：2周

步驟4. 轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf-9：

1.利用轉(zhuǎn)染試劑將重組Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf-9。

2.收集成熟的重組桿狀病毒并檢測(cè)病毒的滴度。

3.通過(guò)多次感染提高病毒的滴度，并擴(kuò)增病毒數(shù)量。

4.通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。

交付內(nèi)容：高滴度重組桿狀病毒，病毒滴度及蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（如果轉(zhuǎn)染不成功，則不收取費(fèi)用。如果沒(méi)有檢測(cè)到目標(biāo)蛋白表達(dá)，則只收取50%實(shí)驗(yàn)費(fèi)用）。

時(shí)間：3周

步驟5. 目標(biāo)蛋白表達(dá)及純化：

1.培養(yǎng)500ml昆蟲(chóng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，然后加入適量病毒感染細(xì)胞并表達(dá)目標(biāo)蛋白。

2.收集含有目標(biāo)蛋白的部分（細(xì)胞或培養(yǎng)上清）。

3.通過(guò)親和，離子交換，疏水及凝膠過(guò)濾等多種層析方法純化表達(dá)的重組蛋白。

4.通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)每步結(jié)果并控制zui終產(chǎn)品質(zhì)量。

5.通過(guò)Western-blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白正確性。

6.可提供表達(dá)細(xì)胞株：Sf-9，Sf-9 Mimic，High Five。

交付內(nèi)容：純化好的目標(biāo)蛋白0.1~2mg及純化報(bào)告。可按客戶要求提供含純化標(biāo)簽（Tag）或切除純化標(biāo)簽（Tag）的zui終蛋白，純度zui高可達(dá)90%以上。

時(shí)間：2-3周

說(shuō)明：

1. 如果沒(méi)有獲得目標(biāo)蛋白，則不收取任何費(fèi)用。如果zui終得到的產(chǎn)品未達(dá)到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費(fèi)用。

2. 如果客戶需要詳細(xì)的純化工藝，包括詳細(xì)純化條件及每步結(jié)果，則需要加收100%相應(yīng)費(fèi)用。

3. 因?yàn)槊總€(gè)重組蛋白的表達(dá)量及純化得率都不相同，我們zui終根據(jù)實(shí)際情況將給客戶提供zui少0.1mg，zui多2mg的目標(biāo)蛋白，所收取的費(fèi)用是相同的。

4. 我們提供的zui終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因?yàn)槲覀儫o(wú)法為每個(gè)定制的蛋白建立活性檢測(cè)系統(tǒng)，所以我們無(wú)法保證zui終產(chǎn)品的生物學(xué)活性，不過(guò)我們承諾將會(huì)按照zui大可能保護(hù)其活性的方法來(lái)制備目標(biāo)蛋白。如果客戶一定要求目標(biāo)蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測(cè)活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標(biāo)蛋白給客戶并只收取本步驟費(fèi)用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標(biāo)蛋白給客戶并需要加收本步驟費(fèi)用的100%。

5. 每次Western-blot檢測(cè)zui多7個(gè)樣品，因?yàn)橐尤腙?yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以及Marker。本步驟只包含一次免費(fèi)檢測(cè)，如果需要更多次檢測(cè)則需另收費(fèi)。我們可以免費(fèi)為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測(cè)結(jié)果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測(cè)結(jié)果（可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或是假陰性的結(jié)果）。如果結(jié)果不正常，我們可以免費(fèi)重做一次。

步驟6. 目標(biāo)蛋白的再加工及詳細(xì)檢測(cè)：

1內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進(jìn)一步加工。

2通過(guò)HPLC，質(zhì)譜等方法詳細(xì)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的質(zhì)量。

服務(wù)內(nèi)容：

1：除內(nèi)毒素，

2：過(guò)濾除菌，

3：凍干，

4：HPLC檢測(cè)，

5：質(zhì)譜檢測(cè)，

6：N端測(cè)序。

交付內(nèi)容：加工后的終產(chǎn)品及相關(guān)實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟7. 大規(guī)模制備：

按照小試工藝放大生物試劑規(guī)模，制備客戶需要的合格蛋白產(chǎn)品。

交付內(nèi)容：合格的目標(biāo)蛋白及服務(wù)報(bào)告。

時(shí)間：協(xié)商

四：哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

步驟1. 目標(biāo)基因全基因合成：

1.從基因庫(kù)中搜索目標(biāo)蛋白的cDNA序列。

2.根據(jù)選用的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)cDNA進(jìn)行密碼子，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等的優(yōu)化。

3.合成設(shè)計(jì)好的基因序列。

交付內(nèi)容：目的基因（在T載體或常規(guī)穿梭載體上）及測(cè)序報(bào)告。

時(shí)間：2-3周

步驟2.：目標(biāo)基因亞克隆到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體

1.擴(kuò)增并抽提含有目標(biāo)基因的載體質(zhì)粒。

2.將目標(biāo)基因亞克隆到真核表達(dá)載體上。

3.測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

4.通過(guò)中抽獲得重組的質(zhì)粒DNA

交付內(nèi)容：正確構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測(cè)序報(bào)告。

時(shí)間：2周

步驟3. 小量轉(zhuǎn)染并通過(guò)Western-blot檢測(cè)表達(dá)：

1.利用轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。

2.從轉(zhuǎn)染后24到72小時(shí)，每12小時(shí)取樣，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。

3.可提供表達(dá)細(xì)胞株：293，293T，NIH/3T3，COS-7，CHO。

交付內(nèi)容：目標(biāo)蛋白表達(dá)結(jié)果。

時(shí)間：2周

說(shuō)明：

1. 如果轉(zhuǎn)染不成功，則不收取費(fèi)用。如果沒(méi)有檢測(cè)到目標(biāo)蛋白表達(dá)，也要收取80%實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。

2.每次Western-blot檢測(cè)zui多7個(gè)樣品，因?yàn)橐尤腙?yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以及Marker。我們可以免費(fèi)為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測(cè)結(jié)果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測(cè)結(jié)果（可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或? 是假陰性的結(jié)果）。如果結(jié)果不正常，我們可以免費(fèi)重做一次。

步驟4. 目標(biāo)蛋白表達(dá)及純化：

1.培養(yǎng)500ml哺乳動(dòng)物細(xì)胞，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)生目標(biāo)蛋白。

2.收集含有目標(biāo)蛋白的部分（細(xì)胞或培養(yǎng)上清）。

3.通過(guò)親和，離子交換，疏水及凝膠過(guò)濾等多種層析方法純化表達(dá)的重組蛋白。

4.通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)每步結(jié)果并控制zui終產(chǎn)品質(zhì)量。

5.通過(guò)Western-blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白正確性。

交付內(nèi)容：純化好的目標(biāo)蛋白及純化報(bào)告?？砂纯蛻粢筇峁┖兓瘶?biāo)簽（Tag）或切除純化標(biāo)簽（Tag）的zui終蛋白，純度zui高可達(dá)90%以上。

時(shí)間：3-4周

說(shuō)明：

1. 如果沒(méi)有獲得目標(biāo)蛋白，則不收取任何費(fèi)用。如果zui終得到的產(chǎn)品未達(dá)到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費(fèi)用。

2. 如果客戶需要詳細(xì)的純化工藝，包括詳細(xì)純化條件及每步結(jié)果，則需要加收100%相應(yīng)費(fèi)用

3. 因?yàn)槊總€(gè)重組蛋白的表達(dá)量及純化得率都不相同，我們zui終根據(jù)實(shí)際情況將給客戶提供zui少0.1mg，zui多2mg的目標(biāo)蛋白，所收取的費(fèi)用是相同的。

4. 我們提供的zui終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因?yàn)槲覀儫o(wú)法為每個(gè)定制的蛋白建立活性檢測(cè)系統(tǒng)，所以我們無(wú)法保證zui終產(chǎn)品的生物學(xué)活性，不過(guò)我們承諾將會(huì)按照zui大可能保護(hù)其活性的方法來(lái)制備目標(biāo)蛋白。如果客戶一定要求目標(biāo)蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測(cè)活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標(biāo)蛋白給客戶并只收取本步驟費(fèi)用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標(biāo)蛋白給客戶并需要加收本步驟費(fèi)用的100%。

5. 每次Western-blot檢測(cè)zui多7個(gè)樣品，因?yàn)橐尤腙?yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以及Marker。本步驟只包含一次免費(fèi)檢測(cè)，如果需要更多次檢測(cè)則需另收費(fèi)。我們可以免費(fèi)為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測(cè)結(jié)果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測(cè)結(jié)果（可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或是假陰性的結(jié)果）。如果結(jié)果不正常，我們可以免費(fèi)重做一次。

步驟5. 目標(biāo)蛋白的再加工及詳細(xì)檢測(cè)：

1.內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進(jìn)一步加工。

2.通過(guò)HPLC，質(zhì)譜等方法詳細(xì)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的質(zhì)量。通過(guò)親和，離子交換，疏水及凝膠過(guò)濾等多種層析方法純化表達(dá)的重組蛋白。

服務(wù)內(nèi)容：

1：除內(nèi)毒素，

2：過(guò)濾除菌，

3：凍干，

4：HPLC檢測(cè)，

5：質(zhì)譜檢測(cè)，

6：N端測(cè)序。

交付內(nèi)容：加工后的終產(chǎn)品及相關(guān)實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)報(bào)告。

時(shí)間：2周

步驟6. 篩選穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株：

1.將轉(zhuǎn)染后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，然后加入含有MTX的培養(yǎng)基。

2.當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到大約2/3孔時(shí)，取培養(yǎng)上清檢測(cè)表達(dá)。

3.挑出高表達(dá)的細(xì)胞團(tuán)用于下一輪篩選，并在下一次細(xì)胞培養(yǎng)基中提高M(jìn)TX的濃度。

4.重復(fù)加壓篩選過(guò)程，提高細(xì)胞株的表達(dá)量直到獲得合適的穩(wěn)定表達(dá)株。

5.通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)每步表達(dá)結(jié)果。

6.通過(guò)Western-blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白正確性。

交付內(nèi)容：穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞株及篩選報(bào)告。

時(shí)間：6-8周

說(shuō)明：因?yàn)槊總€(gè)重組蛋白的表達(dá)量受多種條件影響，我們并不能保證zui終穩(wěn)定株的表達(dá)量，但一般只有瞬時(shí)表達(dá)時(shí)表達(dá)量的1/10左右。

步驟7. 大規(guī)模制備：

按照小試工藝放大生物試劑規(guī)模，制備客戶需要的合格蛋白產(chǎn)品。

交付內(nèi)容：合格的目標(biāo)蛋白及服務(wù)報(bào)告。

時(shí)間：協(xié)商