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          丙酮酸脫羧酶(PDC)測(cè)試盒的操作步驟

          更新時(shí)間:2023-12-06      瀏覽次數(shù):553

          丙酮酸脫羧酶(PDC)測(cè)試盒的操作步驟

          Pyruvate Decarboxylase Kit,PDC 分光光度法)

          一、測(cè)定原理:

          PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛,添加乙醇脫氫酶

          ADH)來(lái)進(jìn)一步催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+;

          NADH 340nm有吸收峰,而NAD+沒(méi)有;通過(guò)測(cè)定340nm

          光吸收下降速率,來(lái)計(jì)算PDC 活性。

          二、測(cè)定意義:

          PDC主要存在于酵母中,是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一,催

          化丙酮酸脫羧生成乙醛。

          三、自備儀器或用品:

          研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL石英比

          色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

          四、試劑盒組成(50T/48 )

          試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。

          試劑二:液體×1 瓶,4℃保存。

          試劑三:液體×1 瓶,4℃保存。

          試劑四:粉劑×1 瓶,﹣20℃保存。

          試劑五:液體×1 瓶,﹣20℃保存。

          混合試劑:臨用前配制,小心把試劑四和五轉(zhuǎn)移到試劑三中,

          充分溶解。

          試劑六:液體×1 瓶,4℃保存。

          五、粗酶液提取:

          1、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后

          棄上清;按照每200 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取

          液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率200W,工作3s

          間歇10s,工作35次),16000g 4℃離心20min,取上

          清,置冰上待測(cè)。

          2、組織處理:按照組織質(zhì)量(g:提取液體積(mL)15

          10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)

          進(jìn)行冰浴勻漿,16000g 4℃離心20min,取上清,置

          冰上待測(cè)。

          3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)

          六、操作步驟:

          注:εNADH 摩爾消光系數(shù),6.22×10 3L/mol/cm

          d比色皿光徑,1cm

          V 反應(yīng)體系總體積,1mL=0.001 L;

          V 加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.1mL;

          Cpr蛋白濃度,mg/mL(需要另外測(cè)定,建議使用本

          公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒);

          W樣本質(zhì)量,g;

          V 樣總加入提取液體,1mL;

          細(xì)胞數(shù):細(xì)胞總數(shù)量,10 4個(gè);

          T反應(yīng)時(shí)間,1 min。

          丙酮酸脫羧酶(PDC)測(cè)試盒的操作步驟



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