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          WB蛋白印跡蛋白質(zhì)電泳分離的操作步驟

          更新時(shí)間:2023-04-06      瀏覽次數(shù):535
          WB蛋白印跡蛋白質(zhì)電泳分離的操作步驟:


          1.樣本處理
          蛋白質(zhì)樣本首先經(jīng)過(guò)離心(4 ℃,15000 r/min 離心 30 分鐘)除去不溶物,再經(jīng) SDS 上樣緩沖液 100 ℃ 變性 3~5 分鐘,使帶有強(qiáng)負(fù)電荷的 SDS 與帶有較弱電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,大量 SDS 可掩蓋蛋白質(zhì)自身的電荷量,只顯示 SDS 的負(fù)電荷,在 pH8.6~pH8.8 的 Tris-甘氨酸不連續(xù) SDS-PAGE 系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)的泳動(dòng)與自身電荷量無(wú)關(guān),只和其分子大小有關(guān),從而將蛋白質(zhì)按分子量大小順序分離。
          電泳樣品中總蛋白質(zhì)濃度不能超過(guò)凝膠系統(tǒng)的裝載能力,可采用微型電泳系統(tǒng)時(shí),每一個(gè)加樣孔內(nèi)的總蛋白量不能大于 5 μg,目的蛋白量在 10 ng 左右較好,蛋白量過(guò)高將出現(xiàn)拖尾或蛋白帶融合現(xiàn)象。蛋白質(zhì)樣本如經(jīng)過(guò)濃縮,須用合適緩沖液透析除鹽后上樣,否則在高鹽狀態(tài)下電泳將出現(xiàn)電泳帶扭曲的現(xiàn)象。
          2.凝膠選擇
          根據(jù)目的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的凝膠濃度,一般情況下,用于免疫印跡的 SDS-PAGE 凝膠濃度與所分離的蛋白質(zhì)分子量間的關(guān)系如表 1 所示。為提高樣本分辨率,通常采用高一級(jí)凝膠濃度的電泳系統(tǒng),將獲得更好的結(jié)果。
          表 1 凝膠濃度與蛋白分子量的關(guān)系
          凝膠濃度
          分離蛋白質(zhì)范圍(MW)
          8%
          >50000
          10%
          30000~200000
          12%
          20000~150000
          14%
          10000~100000
          17%
          5000~100000
          為使電泳后蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移至固相支持膜上,還須考慮凝膠的濃度及厚度。凝膠的百分含量和交聯(lián)度越低,轉(zhuǎn)移越容易,最軟的凝膠可產(chǎn)生好的轉(zhuǎn)移效率,但凝膠濃度過(guò)低可導(dǎo)致電泳帶變寬、融合,降低分辨率。凝膠越薄,轉(zhuǎn)移效率也就越高,但過(guò)薄的凝膠易碎,導(dǎo)致操作困難。多數(shù)情況下采用 0.5~1 mm 厚凝膠,為提高蛋白上樣量和檢測(cè)敏感度,可適當(dāng)增加凝膠厚度,但不宜超過(guò) 2 mm。


          3.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品選擇蛋白質(zhì)凝膠電泳需要蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(molecular weight marker)指示系統(tǒng),來(lái)顯示電泳的分離效率、轉(zhuǎn)膜效率以及樣本泳動(dòng)情況。SDS-PAGE 凝膠電泳如采用普通蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品,須經(jīng)蛋白質(zhì)染色后才能確認(rèn)上述電泳參數(shù),故問(wèn)題發(fā)現(xiàn)不及時(shí),常常導(dǎo)致無(wú)效的重復(fù)電泳。彩色標(biāo)準(zhǔn)品(rainbow marker)可彌補(bǔ)這一欠缺,如表 2 所示,該 Marker 在電泳凝膠中隨蛋白質(zhì)的遷移,各分子量條帶逐漸分開(kāi),并顯示多種色彩的條帶,可直接肉眼觀察泳動(dòng)及分離情況,當(dāng)目的分子量大小的 Marker 遷移到合適位置(距凝膠底部 1/3 處),同時(shí)其與相鄰兩條 Marker 達(dá)到足夠分辨距離時(shí),即可停止電泳,取出凝膠。蛋白質(zhì)樣本轉(zhuǎn)膜后的轉(zhuǎn)膜效率和目的蛋白質(zhì)分子量,均可通過(guò)彩色標(biāo)準(zhǔn)品直接推算。

          表 2 常用高分子量彩色標(biāo)準(zhǔn)品

          標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)
          分子量
          顏色
          myosin
          200000
          phosphorylase b
          97400
          BSA
          00069
          ovalbumin
          46000
          carbonic anhydrane
          30000
          trypsin inhibitor
          21500
          lysozyme
          14300
          赤紫
          4.SDS-PAGE
          1)安裝電泳裝置和玻璃板。
          2)配制分離膠:按照所需濃度和體積依次混合 H2O,30% 丙烯酰胺,1.5 mol/L Tris(pH8.8),10% SDS,10% 過(guò)硫酸銨,最后加入 TEMED,立即快速混勻。
          3)迅速在兩玻璃板間隙灌入分離膠溶液,留出沉積膠所需體積和梳子齒長(zhǎng)高度。小心地在膠上覆蓋一層去離子 H2O,垂直放置于室溫中,約 30 分鐘使膠凝聚。
          4)倒出分離膠上方覆蓋液體,盡量吸干。
          5)配制 5% 濃縮膠,依次混合 H20,30% 丙烯酰胺,1.5 mol/L Tris(pH8.8),10% SDS,10% 過(guò)硫酸銨,最后加入 TEMED,立即快速混勻。
          6)在分離膠上方灌入濃縮膠,并插入梳子,避免氣泡!再灌入適量濃縮膠填滿梳子齒間縫隙,垂直放置于室溫。
          7)將蛋白樣品加入等量 2X SDS 加樣緩沖液,100 ℃ 加熱 3 分鐘使蛋白變性。2000 r/min,常溫離心 3 分鐘。
          8)取出濃縮膠中梳子,以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。將凝膠裝置固定于電泳裝置中,在上、下槽均加滿 Tris-Glysine 電泳緩沖液。
          9)加樣 10~20 μl。
          10)將電泳裝置通電,電壓 8V/cm,當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后,電壓提高到 15V/cm,電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部,約 2~4 小時(shí)。

          11)關(guān)閉電源,取出玻璃板,撬開(kāi)玻璃板,小心取出凝膠。


          WB蛋白印跡蛋白質(zhì)電泳分離的操作步驟


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